有許多種優化操作，主要取決于您的目的和分析方法的科學性。還是分析時間?從測試的成本中?還是準確?由于目的不同，許多方法需要改變。例如，為了縮短分析時間，需要更多地選擇短柱，更少地使用梯度。如果分析時間長，
分析型液相色譜儀色譜柱需要更長，成本高。
優化應以流動相、液相色譜儀色譜柱、柱溫、檢測器、梯度洗脫和樣品預處理為基礎。
1.流動相選擇：
反相色譜的流動相通常以水為基礎,然后加入一定量的水溶極性調節劑,如甲醇,乙腈,四氫呋喃等,極性調節劑的性質和比例對溶質的保留和分離選擇性有顯著影響。一般來說，甲醇-水體系可以滿足大多數樣品的分離要求，流動相因其粘度低、價格低廉而成為反相色譜Z常用的流動相。但是，我建議您使用乙腈-水體系進行初步實驗，因為乙腈比甲醇具有更高的溶劑強度和更低的粘度，能夠滿足185 ~ 205納米紫外檢測的要求。因此，乙腈-水體系總體上優于甲醇-水體系。在分離極性差異大的多組分樣品時，還需要梯度洗脫技術，以使各組分具有合適的K值并分離良好。在反相色譜中，如果同時分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑的洗滌強度比與乙腈/水或四氫呋喃/水的洗滌強度比有關，具體如下：
C乙腈= 0.32c2 甲醇++0.57C甲醇
C四氫呋喃= =0.66C甲醇
C是不同有機溶劑與水混合的體積百分比含量 100%甲醇的洗滌強度相當于89%乙腈/水或66%四氫呋喃/水的洗滌強度。
乙腈的毒性是甲醇的5倍，乙醇的25倍 價格是甲醇的6~7倍。
由于硅膠表面的硅輕基團(SiOH)或其他極性基團的極性很強，分離順序基于樣品中各組分的極性，即先將極性較弱的組分沖出液相色譜儀的色譜柱。
正相色譜中使用的流動相的極性相對低于固定相，如己烷、氯氟烴、亞甲基氯醚等。
正相色譜的固定相通常是硅膠和其他帶有極性功能胺基的鍵合相填料，如(NH2，APS)和氰基(CN，CPS)
由于硅膠表面的硅輕基團(SiOH)或其他極性基團的極性很強，分離順序基于樣品中各組分的極性，即先將極性較弱的組分沖出液相色譜儀的色譜柱。
2.流動相酸堿度的選擇:大多數反相色譜柱的酸堿度穩定范圍為2-7.5，不應該超過分析型液相色譜儀色譜柱的酸堿度范圍。C18色譜柱的一般ph范圍為2-8。當流動相的ph值小于2時，鍵合相將發生水解。當弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品用液相色譜儀的反相色譜分離時，調整流動相ph值的技術稱為反相對于弱酸，流動相的酸堿度越小，組分的鉀值就越大。當酸堿度遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在。對于弱勢群體，情況正好相反。當分析弱酸樣品時，通常向流動相中加入少量弱酸，并且通常使用50摩爾/升磷酸鹽緩沖液和1%乙酸溶液。分析弱堿樣品時，
通常在流動相中加入少量弱堿，通常為50摩爾/升磷酸鹽緩沖液和30摩爾/升三乙胺溶液。注：在流動相中加入有機胺,可以減弱堿性溶液與殘余硅烷醇之間的強相互作用,減少或消除峰尾現象,因此,在這種情況下,有機胺(如三乙胺)也稱為去尾劑或清除劑。
3.波長選擇:首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液體的吸收光譜，選擇合適的測量波長，如Z靈敏的測量波長，避免其他物質的干擾分析型液相色譜儀中的響應值通常也可以從紫外光譜中得知。如果吸光度小于0.5，用液相色譜儀(高效液相色譜法)法測定的面積將非常小。
